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in situ ハイブリダイゼーション

in situ ハイブリダイゼーション
in situ ハイブリダイゼーションを実施します

商品説明

in situ ハイブリダイゼーションは、組織中で目的遺伝子の発現部位を解析する方法です。
組織切片を用いて組織における細胞レベルでのmRNAの分布を調べる方法(切片 in situ ハイブリダイゼーション)と胚を丸ごと処理して胚全体における空間的なmRNAの分布を調べる方法(ホールマウント in situ ハイブリダイゼーション)の2種類の方法を実施することが可能です。
また、プローブ作製のみを実施することも可能です。

本サービスは、株式会社徳島分子病理研究所との業務提携により提供します。






仕様

● 基本
プローブ作製
切片 in situ ハイブリダイゼーション
ホールマウント in situ ハイブリダイゼーション

● 特殊分析
CISH (Chromogen in situ Hybridization)
FISH (Fluorescenece in situ Hybridization)

※FISH、CISH用プローブは、実費請求もしくはご提供いただくことになります。

CISH (Chromogen in situ Hybridization) とは?
色素を用いて組織標本上で染色体DNAを検出する in situ ハイブリゼーションです。
●組織形態とCISHシグナルが同時に観察できます。シグナルは半永久的でスライドは室温で保存可能です。
●ヘマトキシリン染色等と組み合わせることで移植した細胞や遺伝子導入した細胞の組織内分布を調べる場合にも利用することができます。

FISH (Fluorescenece in situ Hybridization) とは?
蛍光標識したクローン化DNAを用いてハイブリダイゼーションを行い、目的の染色体DNAを検出します。
●シグナルは、静止期にある核からでも明瞭に検出できるため、染色体の数的異常、転座や遺伝子増幅なども解析可能です。

高感度の in situ ハイブリダイゼーション「ViewRNA ISH解析」サービスを開始いたしました。
詳しくはこちら

サンプル

切片:マウス組織(脳、心臓、腎臓、肝臓、脾臓etc)、
胚ホールマウント:マウス胚(特にご希望がなければ10.5日胚で実施します)

サンプル調製方法

プローブをご提供いただく場合

プローブの標識について
プローブの標識には、DIG(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いてください。DIG以外の標識プローブに関しましては、ご相談ください。放射性同位体により標識されたプローブやRNA以外のプローブは対応できません。

プローブの設計について
目的の遺伝子にアイソフォームが存在する場合には、特異的な配列であるかどうかにご注意ください。
分析に適したプローブの長さは、0.5 kb ~1.5 kb を推奨しております。
プローブを長くすると、シグナルを増強し非特異的なハイブリダイズを抑える事が可能ですが、細胞内のmRNAへのアクセスする確率が下がる場合があります。

解析に必要なプローブ量について
切片の場合は、1解析あたり2μg 以上のRNAプローブ(アンチセンス、センス共に)をご用意ください。
ホールマウントの場合は、1解析あたり4μg 以上のRNAプローブ(アンチセンス、センス共に)を
ご用意ください。

プローブのTm値について
分析の条件を決定する上で、プローブのTm値(融解温度)が重要です。
Tm値はGC塩基対の含量、DNAの長さ、DNA塩基のミスマッチ、プローブ融解液の組成から算出できます。
Tm( ℃)= 81.5+16.6(logM )+ 0.41(%G + C)-0.72(%formamide)-500/L
M:1価の正イオンのモル濃度
%G+C:プローブのGC含量
% formamide:ホルムアミド濃度
L:プローブの長さ(base)

プローブ作製からご依頼いただく場合

RNAプローブを作製するための鋳型DNAについて
鋳型となるDNAをご提供ください。サンプルは、事前に電気泳動を実施していただき、
泳動結果をご添付ください。
鋳型となるDNAをお持ちでない場合は、別途費用が必要となりますので、事前にご相談ください。
DNAは1μg 必要です。テンプレートDNAへの RNase の混入には十分注意してください。
RNaseの混入が予想される場合は、事前にPCI処理-エタノール沈殿等を行う事をお薦めします。

組織等の解析サンプルをご提供いただく場合

固定法について
in situ ハイブリダイゼーションに用いるサンプルの固定には、4%パラホルムアルデヒドを用います
(未固定凍結組織や他の固定法についてはご相談ください)。
重要なポイントはRNAが分解しないように速やかに固定することです。
マウスの場合、灌流固定を行い、組織の取り出し後、速やかに固定して下さい。
大きな組織の場合は、固定液が浸透しやすいよう、組織の必要な部位のみをトリミングしてください。
RNaseフリーの環境下でサンプリングを行ってください。
剥離防止コート処理(MAS等)されたスライドガラスを用いてください。
詳しくは、下記補足をご参照ください。

補足:切片について

弊社では切片の作製には主にパラフィン法と凍結法を用いております。切片作製の際の注意点をご紹介いたしますので、切片をご提供していただく場合はもちろん、切片作製からご依頼いただく方も、ぜひご一読ください。

各切片の特徴

パラフィン切片
利点:
形態保持に優れており、パラフィンブロックは比較的長期間保存でき、安定に組織や胚を保存することが可能です。
欠点:
操作に時間が掛かる上、有機溶媒を用いるため、脂質は失われ、加温のために、タンパク質の抗原性が失われる可能性があります。

凍結切片
利点:
比較的短時間の操作で作製できる上、核酸のシグナル検出感度やタンパク質の抗原性の保持が比較的高いといわれております。こちらは有機溶媒を用いないので、中性脂質は損なわれません。
欠点:
形態の保持が困難です。乾燥が不十分であると容易にスライドガラスから切片が剥離します(再固定によって改善できる場合があります)。組織によっては凍結ブロックで長期間保存出来ない場合があります。

固定法について

in situ ハイブリダイゼーションに用いるサンプルの固定は、下記の手順で実施することを推奨しております。
固定液中のサンプルを送付していただくことはできませんので、エタノールに置換した状態でサンプルを送付ください。なお、全ての操作は、RNaseが混入しない環境で実施してください。

4%パラホルムアルデヒド固定、アルコールによる脱水
組織の体積の10倍量以上の 4%パラホルムアルデヒド/PBT(0.1%Tween in PBS) (RNase-free) 溶液で約1時間の固定(4℃)を行ってください。 さらに液交換を行った後、12時間以上(4℃)の固定を行ってください。
次に、下記の操作でアルコールによる脱水を行ってください。
 1. PBT (RNase-free)     10分×2回(4℃)
 2. 25% Et-OH / PBT (RNase-free)  10分 (4℃)
 3. 50% Et-OH / PBT (RNase-free)  10分 (4℃)
 4. 75% Et-OH / H2O (RNase-free) 10分 (4℃)
 5. 100% Et-OH   10分×2回(4℃)
 6. 冷凍保存(-20℃)
固定・脱水後のサンプルを送付される場合は、コニカルチューブを100% Et-OH で満たし、
液が漏れないように密封し、冷凍便でお送りください。

固定液の作製法
20% パラホルムアルデヒド溶液(50 mL)の調製
10 g の PFA 粉末に 30 mL の超純水を加え、10 N NaOH を 100 μ加え、65℃で溶解させる。
パラホルムアルデヒド が溶解後、超純水で50 mL にメスアップする。
氷上にて冷却後、0.45μm 径のフィルターで濾過して使用する。
使用直前に20%パラホルムアルデヒド溶液をPBSで5倍に希釈し、4%パラホルムアルデヒド/PBSとする。

作製の注意点

in situ ハイブリダイゼーションに用いる切片は、RNaseの混入しない環境で切片を作製する必要があります。
手袋・マスクを着用し、ヒトの汗や唾液等の混入を防止してください。
サンプルは高温下で長時間処理されますので、切片作業に用いるスライドガラスは
剥離防止コート処理(MAS等)されたスライドガラスを用いてください。

薄切面の指定

希望する組織の薄切面をご指定していただくことは、とても重要な情報です。脳や心臓のように組織に方向性がある組織の場合、断面を指定していただく必要があります。例えば脳の場合、水平面、環状面、矢状面であるか、また基準となるブレグマや正中面からの位置を指定していただきます。他の組織の場合も切片の断面をできるだけ詳細に指定してください。

マウス脳断面の模式図

水平面、環状面、矢状面のどの断面であるか、またどの位置で切断するかという情報が必要です。
下にはマウス脳をどのように薄片化しているのかを模式的に示しています。上から環状面、水平面、矢状面の
切断位置を赤線で示しています。各断面にそれぞれ薄切した切片のHE染色像を右に示します。
このように切断面を指定していただくことがとても重要です。


リスク

本分析を実施の際には、組織に応じたポジティブコントロールの分析を同時に行います。
コントロールで発現が見られているにも関わらず、目的遺伝子の発現が確認されなかった場合には、
発現量が検出感度以下であるとして結果を報告いたします。
上記の場合も、分析費用は請求させていただく事になりますので、発現量の低い遺伝子である場合等は、
十分にご検討ください。
サンプルをご提供いただく場合は、RNAの分解にお気を付けください。サンプル調製に関しましては、
特に固定法が最も重要ですので固定法に関する項目をご覧ください。
ご提供いただく核酸につきましては、核酸の分解およびRNaseの混入にご注意ください。
RNAプローブの保存や輸送に関しては、プリザベーションプレート(WATSON)を推奨しております。








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